一、PCR檢測(cè)的應(yīng)用

PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)作為分子生物學(xué)領(lǐng)域的核心檢測(cè)手段，廣泛應(yīng)用于微生物病原體檢測(cè)、基因篩查和診斷、司法鑒定、遺傳疾病的檢測(cè)、藥物代謝評(píng)估等多個(gè)領(lǐng)域。其原理是DNA片段擴(kuò)增，根據(jù)特異性的引物擴(kuò)增目的片段，通過片段大小或者結(jié)合探針實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸的檢測(cè)，而這一過程的前提是獲得高質(zhì)量、高純度的核酸模板。核酸提取作為PCR檢測(cè)的前處理重要環(huán)節(jié)，其提取效果直接決定了PCR反應(yīng)的成敗、檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。

二、核酸提取回收率對(duì)PCR反應(yīng)特異性的影響

核酸提取過程中若殘留雜質(zhì)，會(huì)顯著干擾PCR反應(yīng)的特異性，甚至抑制擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行。同樣核酸提取效率對(duì)低豐度樣本檢測(cè)的影響。對(duì)于低豐度目標(biāo)核酸樣本（如早期感染階段的病原體樣本、微量組織樣本、降解嚴(yán)重的DNA樣本等），核酸提取效率直接影響了能否從樣本中捕獲到足夠的目標(biāo)核酸。若提取方法的回收率低，即使樣本中存在目標(biāo)核酸，也可能因提取過程中的損失導(dǎo)致獲得的模板量低于PCR檢測(cè)的低檢出限，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

三、PCR檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)大小鼠微生物病毒病原菌檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

常規(guī)樣本的病毒檢測(cè)方法，多采取血清學(xué)方法，血清學(xué)檢測(cè)方法包括：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA，免疫酶試驗(yàn)IEA，免疫熒光試驗(yàn)IFA等抗體檢測(cè)方案。

病原菌的檢測(cè)方案則多是培養(yǎng)法，有些需要進(jìn)行生化反應(yīng)進(jìn)行鑒定。

國(guó)標(biāo)GB14922－2022中規(guī)定了大小鼠的病毒、病原菌（細(xì)菌真菌）的檢測(cè)項(xiàng)目，分為必須檢測(cè)項(xiàng)目和必要時(shí)檢測(cè)項(xiàng)目。

除此之外，隨著分子生物學(xué)檢測(cè)方法的進(jìn)步，熒光定量PCR成為用于檢測(cè)病毒感染的常用的方法。熒光定量PCR檢測(cè)是通過檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來判斷是否存在病毒或病毒含量的高低。不同的熒光標(biāo)記物也使得多重檢測(cè)成為可能，比如一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)可見檢測(cè)多重?zé)晒釬AM、HEX、ROX 熒光，每種熒光探針標(biāo)記1-3種病毒，從而可以實(shí)現(xiàn)一個(gè)孔中多種病毒的檢測(cè)。

熒光定量PCR檢測(cè)病毒時(shí)所需的樣本量少、更是可以在疾病早期檢測(cè)到病毒感染，特異性高，也得到了廣泛的應(yīng)用和重視。翼和生物開發(fā)了多款qPCR檢測(cè)試劑盒，可進(jìn)行多種病原體的聯(lián)檢或者鑒定。分兩種試劑盒，一種qPCR試劑盒是聯(lián)檢試劑盒，能判斷樣本是否感染國(guó)標(biāo)規(guī)定的幾種病毒或者病原菌，并且出現(xiàn)陽(yáng)性的話可鎖定在2-3種病原的范圍，但是確定具體哪種病原感染則需要搭配鑒定試劑盒進(jìn)行具體病原的鑒定。但是一般SPF來源的鼠樣本都是比較干凈，檢測(cè)常為陰性，所以無需進(jìn)行特定病原的鑒定。鑒定試劑盒中一個(gè)熒光通道只鑒定一種病原，所以可以通過熒光通道直接判斷感染的具體病原。

四、核酸提取回收率對(duì)實(shí)驗(yàn)大小鼠病原微生物檢測(cè)的影響

熒光定量PCR檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)，一般高于10 copies/μl的核酸病毒樣本可被檢測(cè)到。但是前提時(shí)核酸提取的流程正常。對(duì)于微量核酸的DNA、RNA提取流程如何保障樣本的核酸提取質(zhì)量呢？可以從幾個(gè)角度進(jìn)行：

1）購(gòu)買來源正規(guī)的廠家核酸提取試劑盒產(chǎn)品。

2）提取過程中可以設(shè)置對(duì)照，比如標(biāo)準(zhǔn)菌株或者假病毒加入到樣本中，看看核酸提取過程是否可以正常完成樣本的提取，回收率是否正常。

3）提取過程中加入外源的其他物種的核酸，作為內(nèi)參，質(zhì)控提取過程。比如翼和生物的DNA/RNA提取試劑盒就含有外源基因組DNA作為內(nèi)參，可以參與核酸的提取過程，質(zhì)控提取過程，如果核酸提取過程正常，則PCR后所有樣本都應(yīng)該有人為加入的外源核酸的信號(hào)，并且這個(gè)信號(hào)不影響目標(biāo)病原體的檢測(cè)。

綜上所述，核酸提取作為PCR檢測(cè)的上游環(huán)節(jié)，其質(zhì)量和回收效率直接影響PCR擴(kuò)增的效率、特異性與靈敏度，是決定檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性、可靠性的重要因素。因此在實(shí)際檢測(cè)中，需根據(jù)樣本特性區(qū)分，選擇合適的提取方法，以獲得高質(zhì)量的核酸模板，才能充分發(fā)揮PCR技術(shù)的高靈敏度、高特異性優(yōu)勢(shì)，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原微生物的檢測(cè)等領(lǐng)域提供可靠的檢測(cè)數(shù)據(jù)。