表觀遺傳學(xué)(epigenetics)是目前分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要內(nèi)容，是基因組DNA的主要表觀遺傳修飾形式之一。DNA甲基化修飾對(duì)于維持正常細(xì)胞功能、傳遞基因組遺傳印記、胚胎發(fā)育、衰老以及人類tumour發(fā)生，起著至關(guān)重要的作用。

全基因組甲基化研究方法主要有全基因組甲基化芯片、全基因組甲基化重測(cè)序(WGBS)和簡化亞硫酸氫鹽測(cè)序技術(shù)（RRBS），這些方法其實(shí)都有個(gè)共同的特點(diǎn)：信息量大，得到差異甲基化區(qū)域（DMR）非常多，但是價(jià)格昂貴，對(duì)個(gè)別區(qū)域覆蓋度和測(cè)序深度不足，可能會(huì)導(dǎo)致遺漏或假陽性結(jié)果。因此，對(duì)這些方法篩選出來DMR，需要做進(jìn)一步的驗(yàn)證，在隊(duì)列樣本中對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行甲基化檢測(cè)，并分析目標(biāo)區(qū)域與疾病/性狀的關(guān)聯(lián)，才能進(jìn)一步為疾病與該DMR的關(guān)聯(lián)提供流行病學(xué)的證據(jù)。

Hi-MethylSeq簡介

目標(biāo)區(qū)域甲基化重測(cè)序（Hi-MethylSeq），又叫重亞硫酸鹽擴(kuò)增子測(cè)序（Bisulfite Amplicon Sequencing，BSAS）。在前期全基因組甲基化測(cè)序、全基因組甲基化芯片等工作基礎(chǔ)上，或者依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道目的基因甲基化與性狀/疾病關(guān)聯(lián)，選擇感興趣的目的區(qū)間或候選基因，利用Hi-MethylSeq技術(shù)對(duì)大規(guī)模群體的候選基因甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)。

Hi-MethylSeq技術(shù)通過亞硫酸氫鹽（bisulfite）處理，用多重PCR擴(kuò)增目的片段，添加barcode和測(cè)序通用接頭，在Illumina X10二代測(cè)序平臺(tái)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序，利用生物信息學(xué)方法，精確定量計(jì)算目標(biāo)區(qū)間內(nèi)的甲基化位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，在完成目標(biāo)區(qū)域檢測(cè)的同時(shí)大幅降低研究費(fèi)用。

優(yōu)勢(shì)及應(yīng)用方向

1、優(yōu)勢(shì)

Hi-Methylseq結(jié)合了亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換、靶向擴(kuò)增子高通量測(cè)序技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)多區(qū)段、多位點(diǎn)的甲基化精確定量分析，特別適合隊(duì)列樣本目標(biāo)區(qū)域的甲基化分析，測(cè)序深度高，結(jié)果更加準(zhǔn)確。

2、應(yīng)用

（1）適用于感興趣的目的片段甲基化研究 ；

（2）適用于在大樣本中進(jìn)一步確認(rèn)全基因組甲基化研究挑選的陽性位點(diǎn)（DMR）。

3、方向

農(nóng)口：表觀遺傳學(xué)研究、品種鑒定、品種改良

醫(yī)口：tumour早期診斷、表觀遺傳學(xué)生物標(biāo)志物開發(fā)、tumour復(fù)發(fā)的**預(yù)測(cè)因子

Hi-MethylSeq關(guān)鍵結(jié)果

結(jié)果對(duì)比

與標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果一致，但更有優(yōu)勢(shì)

Hi-MethylSeq與BSP結(jié)果一致，而Hi-MethylSeq在研究DNA甲基化時(shí)，每一個(gè)read 都相當(dāng)于克隆測(cè)序時(shí)的一個(gè)單克隆，每個(gè)區(qū)段得到成千上百個(gè)reads,所以用二代測(cè)序比亞硫酸氫鹽修飾后的克隆測(cè)序技術(shù)得到的結(jié)果更加精確。

應(yīng)用案例1

復(fù)發(fā)性妊娠丟失（RPL）是指妊娠24周前連續(xù)兩次或兩次以上的自然流產(chǎn)懷孕，占育齡夫婦的1%。表觀遺傳因素，包括某些基因表達(dá)DNA甲基化調(diào)控紊亂可能在RPL中起作用。科研人員利用全基因組甲基化重測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序聯(lián)合分析，鑒定蛻膜和血液中DNA甲基化調(diào)控的RPL相關(guān)基因，并使用翼和生物Hi-MethylSeq進(jìn)行case和control組的關(guān)鍵基因DMR甲基化檢測(cè)。終發(fā)現(xiàn)，SGK1和CREB5的異常甲基化可能是神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)的原因之一，這些基因位于子宮內(nèi)膜，可能是導(dǎo)致生殖失敗的原因之一。SGK3在生殖系統(tǒng)中的作用值得進(jìn)一步調(diào)查。

應(yīng)用案例2

研究人員使用全基因組甲基化芯片聯(lián)合生物信息學(xué)方法來鑒定自身性免疫性疾病GD的差異甲基化區(qū)（DMR），通過構(gòu)建DMR注釋基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）篩選出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因（Hub Gene）。利用翼和生物Hi-MetylSeq技術(shù)分析了關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因的DMR區(qū)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDKN2C、SERPINA1、IRS4，尤其是B3GNT2是潛在的與GD相關(guān)的異常甲基化基因。這些發(fā)現(xiàn)可能是GD疾病中的DNA甲基化的近報(bào)道。

綜上所述，全基因組甲基化測(cè)序分析獲得DMR后，需要在隊(duì)列樣本中進(jìn)行驗(yàn)證，翼和Hi-MethylSeq技術(shù)是WGBS后續(xù)驗(yàn)證的有力工具。

主要參考文獻(xiàn)：Cai et al. Identifying and validating differentially methylated regions in newly diagnosed patients with Graves' Disease. DNA and Cell Biology 2021, 40(3):1-9.

Zhou et al. Genome wide methylation analysis to uncover genes related to recurrent pregnancy loss. Genes & Genomics 2021, 43(4):361-369.